GB 4789.43-2016酶制劑抗菌活性測試用菌
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食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗微生物源酶制劑抗菌活性的測定
4.2 大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)ATCC11229。
4.3 蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)ATCC2。
4.4 環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)ATCC4516。
4.5 化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)ATCC12344。 4.6 粘質(zhì)沙雷菌(Serratiamarcescens)ATCC14041。
5 檢驗程序
微生物源酶制劑抗菌活性的測定檢驗程序見圖1。
6 操作步驟
6.1 試驗菌懸液原液制備
將金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、大腸埃希氏菌(ATCC11229)、蠟樣芽孢桿菌(ATCC2)、環(huán)狀芽孢桿菌(ATCC4516)、化膿性鏈球菌(ATCC12344)、粘質(zhì)沙雷菌(ATCC14041)凍存菌株分別接種于盛有5mLTSB的試管,置36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h進行第一次傳代培養(yǎng),分別挑取第一次傳代培養(yǎng)液1~2環(huán)轉(zhuǎn)種于5mLTSB肉湯,置36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h進行二次傳代培養(yǎng),作為試驗菌懸液原液備用。
試驗菌懸液原液純度檢測:分別挑取試驗菌懸液原液各一環(huán),劃線接種于 TSA 平板,36 ℃±1 ℃
培養(yǎng)20h~24h,觀察純度。
6.2 菌懸液原液濃度測定
6.2.1 菌懸液原液稀釋
分別取6.1中制備的菌懸液原液依次進行十倍梯度稀釋,蠟樣芽孢桿菌和環(huán)狀芽孢桿菌分別制成10-4稀釋液,金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、化膿性鏈球菌、粘質(zhì)沙雷菌分別制成10-5稀釋液。
6.2.2 培養(yǎng)計數(shù)
分別吸取6.2.1中制備好的各菌稀釋液1mL于無菌平皿內(nèi),每個稀釋度做兩個平行,并用無菌生
理鹽水作空白對照。向平皿中傾注冷卻至46℃左右(可放置于46℃±1℃的恒溫水浴箱中保溫)的平板計數(shù)瓊脂15mL~20mL,并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后,將平板翻轉(zhuǎn),于36℃±1℃培養(yǎng)24h后計數(shù),各菌懸液原液中菌濃度均大于106 CFU/mL時方可使用。
6.3 檢測平板制備
傾注融化并冷卻至46℃±1℃的 TSA培養(yǎng)基 15mL于無菌培養(yǎng)皿內(nèi),待其凝固后制成 TSA 平板,備用。
將6.1中二次傳代后的各菌培養(yǎng)物分別用冷卻至46℃±1℃的 TSA 培養(yǎng)基按1∶10的比例稀釋(其中化膿性鏈球菌 ATCC12344按1∶20的比例稀釋),充分混勻后各取10mL至上述已制備好、于46℃±1℃中保溫的 TSA平板內(nèi),輕輕搖動平板使菌液均勻鋪平,待其凝固后制成檢測平板,備用。
注:為防止含菌培養(yǎng)基遇到TSA后馬上凝固,引起菌懸液鋪板不均勻,菌懸液鋪板前應(yīng)事先將TSA平板置于46℃± 1℃條件下保溫平衡10min。
6.4 酶制劑紙片的制備
準(zhǔn)確稱(移)取1.0g(mL)酶制劑于9mL無菌生理鹽水中,充分混勻后制成10%的酶制劑溶液。將無菌紙片放入無菌平皿內(nèi),在每張紙片上緩緩滴加100μL10%的酶制劑溶液,使其全部吸收,每種酶制劑樣品制備12張紙片。
6.5 貼紙片及培養(yǎng)
將6.4中制備的含待測酶制劑的紙片、含環(huán)丙沙星的陽性對照紙片(見 A.7)和含100μL無菌生理鹽水的空白陰性對照紙片用無菌鑷子分別置6.3中制備的檢測平板上,每個平板貼2張紙片(2張含待
測酶制劑的紙片或2張含環(huán)丙沙星的紙片或2張空白紙片),兩紙片圓點的間距大于32mm,每個標(biāo)準(zhǔn)菌株分別設(shè)一陽性對照和一陰性對照平板。將平板正置于4℃±0.5℃冰箱內(nèi)過夜(12h~16h)。第
二天轉(zhuǎn)入36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,測定酶制劑樣品、環(huán)丙沙星和陰性對照紙片形成的抑菌圈。
7 抗菌活性結(jié)果報告
7.1 結(jié)果判定
若待測酶制劑對3種或3種以上受試微生物呈現(xiàn)出抗菌活性,即紙片周圍出現(xiàn)清晰可見的抑菌圈
GB4789.43—2016
(每個抑菌圈直徑≥16mm),且陽性對照環(huán)丙沙星紙片對金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、粘質(zhì)沙雷菌、
環(huán)狀芽孢桿菌、化膿性鏈球菌5種細(xì)菌形成的抑菌圈均>16mm,則判定該酶制劑樣品中存在抗菌活性物質(zhì)。
7.2 結(jié)果報告
報告樣品中檢出抗菌活性或未檢出抗菌活性。
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