涂平板:為取得最佳的感受態(tài)效率,必須先把甘油菌或其它形式保存的菌種涂LB平板,并培養(yǎng)過(guò)夜.接種:取一有新鮮培養(yǎng)的菌種的LB平板,后續(xù)操作均在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行.把鑷子的頂端在70%酒精中蘸一下,并在酒精燈上略略燒一下,使鑷子的頂端處于無(wú)菌狀態(tài).用鑷子夾取一個(gè)無(wú)菌的塑料槍頭或牙簽,從平板上挑取一個(gè)單克隆,然后把蘸有菌種的塑料槍頭或牙簽放到裝有3毫升LB的細(xì)菌培養(yǎng)試管內(nèi).上述操作也可以使用接種環(huán)等進(jìn)行操作.

 

　　培養(yǎng):37℃約200rpm培養(yǎng)過(guò)夜,通常培養(yǎng)時(shí)間控制在16小時(shí)左右為宜.絕對(duì)不宜超過(guò)18小時(shí).再接種培養(yǎng):根據(jù)需要制備的感受態(tài)細(xì)菌的量,按照1:100的比例用新鮮培養(yǎng)的過(guò)夜菌接種培養(yǎng).例如取500微升的新鮮過(guò)夜菌到50毫升的LB中繼續(xù)37℃約200rpm培養(yǎng).通常在大約培養(yǎng)2-2.5小時(shí)后OD600可以達(dá)到0.3-0.5.

 

　　制備感受態(tài)細(xì)菌:在培養(yǎng)的細(xì)菌OD600達(dá)到0.3-0.5時(shí),4℃2000g離心5分鐘收集細(xì)菌.如果離心沉淀前的菌量為50毫升,按后續(xù)操作進(jìn)行,如果是其它體積則按比例換算后進(jìn)行后續(xù)操作.用5毫升預(yù)冷的LB重新懸浮起細(xì)菌沉淀,加入5毫升在冰浴或冰水浴上融解的感受態(tài)制備試劑,混勻,冰浴放置5分鐘.然后再輕輕混勻,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)分裝到1.5毫升或0.5毫升的離心管內(nèi)后-70℃保存.

 

 

　　注:如果以后會(huì)只做單管的轉(zhuǎn)化,可以分裝成每管最少50微升或100微升,如果以后一次性做多個(gè)轉(zhuǎn)化,可以每管分裝500微升或更大體積.-70℃保存后,感受態(tài)的效率會(huì)隨時(shí)間的推移逐漸下降,但通常在半年內(nèi)使用轉(zhuǎn)化效率下降不會(huì)太多.總的來(lái)說(shuō),新鮮制備的感受態(tài)要比凍存的感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率更高一些.