紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈,開(kāi)啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài),用酒精消毒操作者的雙手.將所需的培養(yǎng)基,胰酶確保瓶身干凈后放于工作臺(tái)面內(nèi),點(diǎn)燃酒精燈,將培養(yǎng)基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后,再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒2-3次,旋開(kāi)瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋,分別放于酒精燈的兩側(cè).特別是將培養(yǎng)基瓶放于斜架上,瓶口對(duì)準(zhǔn)酒精燈,且放在距離酒精燈最近的位置,瓶蓋置于酒精燈的另一側(cè)

 

　　將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次,旋開(kāi)后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次,蓋放于酒精燈右側(cè)后將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進(jìn)污缸,在酒精燈消毒2-3次瓶口,豎直放好.取1ml移液器快速移動(dòng)在酒精燈上消毒1-2次,然后再裝上槍頭吸取1.5ml胰酶液,懸空移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)

 

　　將培養(yǎng)使胰酶浸沒(méi)整個(gè)瓶壁的細(xì)胞層,計(jì)時(shí)約40s,立馬豎起對(duì)著燈光可觀(guān)察到細(xì)胞與細(xì)胞之間有針孔樣縫隙,并有1-2個(gè)細(xì)胞脫落,這時(shí)為胰酶消化的最適時(shí)機(jī).若看到成片的細(xì)胞從瓶壁脫落為胰酶消化過(guò)度;若看不到針孔樣縫隙和細(xì)胞脫落,則需繼續(xù)消化,輕輕的迅速平放培養(yǎng)瓶使胰酶浸沒(méi)細(xì)胞層1s后迅速豎起對(duì)著燈光觀(guān)察細(xì)胞情況,可反復(fù)幾次,直至出現(xiàn)針孔樣縫隙和1-2個(gè)細(xì)胞脫落的最佳消化狀態(tài).用移液器將胰酶吸凈

 

　　吸取1ml細(xì)胞凍存液于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復(fù)沖洗培養(yǎng)瓶壁5-8次,使貼壁細(xì)胞完全脫落于培養(yǎng)基內(nèi)再輕輕吹打2-3次,使細(xì)胞盡可能處于單個(gè)懸浮狀態(tài).將1ml含有細(xì)胞的凍存液移入新的保種管內(nèi),擰緊瓶蓋,做好實(shí)驗(yàn)標(biāo)記

 

　　將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊,熄滅酒精燈,整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面,取出實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等,關(guān)閉超凈工作臺(tái).將保種管先放于4℃冰箱30min后拿出放置-20℃冰箱過(guò)夜,次日再放于-80℃的冰箱內(nèi)3-4天,最后存放于-196℃的液氮灌內(nèi)長(zhǎng)期保存

 

　　注此過(guò)程也可簡(jiǎn)化因?qū)嶋H操作過(guò)程中經(jīng)驗(yàn)所得:步驟7結(jié)束后將保種管用干脫脂棉包裹后膠帶封好直接放于-80℃冰箱內(nèi)4-5天,即可放于液氮灌保存.但-80℃冰箱也可保存細(xì)胞株2-3月