五、寄主保存法：

 

即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動(dòng)物、昆蟲、雞胚內(nèi)感染并傳代，此法相當(dāng)于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進(jìn)行保藏。

 

六、冷凍保存法：

 

適用于抗凍力強(qiáng)的微生物。這些微生物可在其菌體細(xì)胞外遭受凍結(jié)的情況下而不受損傷，而對(duì)其它大多數(shù)微生物而言，無論在細(xì)胞外凍結(jié)還是在細(xì)胞內(nèi)凍結(jié)，都會(huì)對(duì)菌體造成損傷，當(dāng)采用這種保藏方法時(shí)，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

 

①要選擇適于冷凍干燥的菌齡細(xì)胞。

 

②要選擇適宜的培養(yǎng)基，因?yàn)槟承┪⑸飳?duì)冷凍的抵抗力，常隨培養(yǎng)基成分的變化而顯示出巨大差異。

 

③要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保存期也越長(zhǎng)。

 

④最好在菌液內(nèi)不添加電解質(zhì)(如食鹽等)。

 

⑤可在菌液內(nèi)添加甘油等保護(hù)劑，以防止在冷凍過程中出現(xiàn)菌體大量死亡的現(xiàn)象。同樣，也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護(hù)效果的溶劑，但對(duì)有些微生物而言，不加保護(hù)劑時(shí)更有效。

 

⑥原則上應(yīng)盡快進(jìn)行冷凍處理，但當(dāng)加入保護(hù)劑時(shí)，可靜置一段時(shí)間后再進(jìn)行處理。

 

⑦就動(dòng)物細(xì)胞而言，應(yīng)在-20℃范圍內(nèi)以1℃/min左右的速度緩慢降溫，此后必須盡快降到貯藏溫度；而對(duì)絕大多數(shù)微生物而言，則不必如此，如結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的原蟲則可在-35℃范圍內(nèi)進(jìn)行緩慢降溫，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進(jìn)行冷凍。

 

⑧若進(jìn)行長(zhǎng)期保存，則貯藏溫度越低越好。

⑨取用冷凍保存的菌種時(shí)，應(yīng)采取速融措施，即在35～40℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說，則應(yīng)選擇靜置融化的措施。當(dāng)冷凍菌融化后，應(yīng)盡量避免再次冷凍，否則菌體的存活率將顯著下降。

 

常用的冷凍保存法包括：

 

①低溫冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃)：

 

低溫冷凍保存時(shí)使用螺旋口試管較為方便，也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時(shí)菌液加量不宜過多，有些可添加保護(hù)劑。此外，也可用φ5mm的玻璃珠來吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器內(nèi)，再放入低溫冰箱內(nèi)進(jìn)行保存的。

 

②干冰保存法(-70℃左右)：

 

即將菌種管插入干冰內(nèi)，再置于冰箱內(nèi)進(jìn)行冷凍保存；

 

③液氮保存法(-196℃)：

 

是適用范圍最廣的微生物保存法。

 

其操作步驟如下：

 

a、裝安瓶管：使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當(dāng)防凍劑(保存霉菌不用防凍劑)的滅菌溶液中，將0.2～1mL的這種溶液分裝于安瓶中，或在裝有分散劑的安瓶中直接接種，或?qū)⒕z體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中。

 

b、熔封安瓶管：若直接貯存于氣相液氮中(-150℃～-170℃)時(shí)，則不需熔封。

 

c、檢查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下，將熔封安瓶管在適當(dāng)?shù)纳厝芤褐薪?～30分鐘后，觀察有無色素進(jìn)入安瓶。

 

d、緩慢冷卻：將熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮?dú)庖约s1℃/min的速度冷卻至-25℃左右，也可在-20℃～-25℃的冰箱內(nèi)緩慢冷卻30～60min。

 

e、速冷：最后浸入液氮中快速冷卻至-196℃。

 

七、冷凍干燥保存法：

 

其原理是首先將微生物冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分。事實(shí)上，從菌體中除去大部分水分后，細(xì)胞的生理活動(dòng)就會(huì)停止，因此可以達(dá)到長(zhǎng)期維持生命狀態(tài)的目的。該方法適用于絕大多數(shù)微生物菌種(包括噬菌體和立克次氏體等)的保存。在進(jìn)行冷凍干燥時(shí)，需注意以下幾個(gè)問題：　

 

a、冷凍干燥前的培養(yǎng)條件：首先檢驗(yàn)菌種純度。一般地說，將待保存的微生物在營(yíng)養(yǎng)豐富且容易增菌的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)為宜;菌齡以達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為好;若為有芽孢或孢子的微生物，則以芽孢和孢子形成以后進(jìn)行保存為好;菌液濃度以高為好，如細(xì)菌應(yīng)達(dá)到109～1010/mL。

 

b、菌株號(hào)碼等的標(biāo)記：可在安瓶外側(cè)標(biāo)記或在安瓶?jī)?nèi)封入標(biāo)簽。

 

c、安瓶的準(zhǔn)備：將安瓶在2%HCl中浸泡過夜，自來水沖洗3次后，蒸餾水刷凈，干燥，塞棉塞，貼標(biāo)簽，干熱滅菌或溫?zé)釡缇螅?0℃恒溫干燥。

 

d、添加保護(hù)劑：常用的保護(hù)劑有脫脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等。甘油管保藏法：在5mL菌種保藏管中，將等體積的菌懸液和40%的甘油充分混勻后，于-20℃冰箱中保存。

 

八、甘油管保藏法：

 

在5ml菌種保藏管中，將等體積的菌懸液和40%的甘油充分混勻后，于-20℃冰箱中保存。