在挑選轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)要注意一些事項(xiàng),比如要明確抗生素的合適濃度、要選擇好抗生素的種類等,那么,為什么要注意這些事項(xiàng)呢?那是因?yàn)槊恳粋€(gè)細(xì)胞株對抗生素的敏感程度是不同的.如果你想確定抗生素的最佳濃度,就必須要在一天之內(nèi)種好多個(gè)細(xì)胞,甚至還要進(jìn)行過夜培育.

 

　　將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基,抗生素濃度按梯度遞增0,50,100,200,400,600,800和1000μg/ml.培養(yǎng)10-14天以絕大部分細(xì)胞死亡濃度為準(zhǔn),一般為400-800μg/ml,篩選穩(wěn)定表達(dá)克隆時(shí)可比該濃度適當(dāng)提高一個(gè)級別維持時(shí)使用篩選濃度的一半.

 

　　轉(zhuǎn)染按前面的步驟進(jìn)行.轉(zhuǎn)染72小時(shí)后按1:10的比例將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在6孔板中傳代,換為含預(yù)試驗(yàn)中確定的抗生素濃度的選擇培養(yǎng)基.在6孔板內(nèi)可見單個(gè)細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)可見單個(gè)細(xì)胞分裂繁殖形成單個(gè)抗性集落,此時(shí)可用兩種方法挑選單克隆.

 

　　濾紙片法:用消毒的5x5mm濾紙片浸過胰酶,將濾紙片貼在單細(xì)胞集落上10-15秒,取出粘附有細(xì)胞的濾紙片放于24孔板中繼續(xù)加壓培養(yǎng).細(xì)胞在24孔板中長滿后轉(zhuǎn)入25cm2培養(yǎng)瓶中,長滿后再轉(zhuǎn)入75cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng).有限稀釋法:將細(xì)胞消化下來后做連續(xù)的10倍稀釋,將每一稀釋度的細(xì)胞滴加到96孔板中培養(yǎng),7-10天后,選擇單個(gè)克隆生長的孔再一次進(jìn)行克隆.

 

　　ELISA或Westernblot檢測單克隆細(xì)胞中外源蛋白的表達(dá)情況由于不同克隆的表達(dá)水平存在差異因此可同時(shí)挑選多個(gè)克隆選擇表達(dá)量最高的克隆傳代并保種.